枯草芽孢杆菌的分离纯化

枯草芽孢杆菌的分离纯化

1. 目的

掌握芽孢杆菌属常见种的分离、鉴定方法和技术。将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。
二．原理
芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。
三．材料和器皿
显微镜 培养皿 试管 三角瓶 烧杯 移液管 涂布棒 载玻片 接种环 接种针 试管架 灭菌锅 培养箱
培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 半固定培养基 淀粉培养基 v.p.实验培养基
孔雀绿溶液 番红复染液 NaOH溶液等
四．操作步骤
菌种的分离和纯化
（1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。
（2）平板的制备：溶化三角瓶中的牛肉汤蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒6个平板。
­­­_­­_­­_­（3）稀释分离法：称取肥土5g放入含有45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15min。而后静止5min，吸取上层液0.1ml加入到含有4.5ml无菌水的试管中，制成1:100浓度的悬液，然后分别吸取10^-2 和 10^-3土壤悬浊液各0.2ml滴加到上述牛肉汤蛋白胨培养基平板上（每种稀释度2皿），用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于37℃恒温培养1-2天。
（4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取2个单菌落中部分菌体，在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化，经菌落特征的观察和镜检，确定是芽孢杆菌属纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置37℃培养1-2天后备用。（菌体应呈杆状，具芽孢，宽度一致；菌落颜色、形状、质地、透明度等均一致）

菌种的鉴定

1. 形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等）

⑴单个菌体的形态
⑵群体形态的观察

2. 革兰氏染色
3. 芽孢染色
4. 菌体大小测量

5枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定

一 过氧化氢酶测定
1原理：过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和氧
2试剂：3—10%过氧化氢   培养基：肉汤琼脂培养基
3操作步骤：将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30培养1—2天。取一干净载玻片，在上面加一滴3—10%的过氧化氢，挑取一环培养1—2天的菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现，记作过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。也可将液直接加入斜面上，观察气泡的产生。

二  需氧性试验
1原理：不同种类的芽孢杆菌对氧气的需求性常有差异，因此本实验可作为鉴定芽孢杆菌的一个较重要指标。
2培养基：半固体培养基
3操作步骤：用一小环的肉汤菌液穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底），一般于30培养3—7天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌
               
三、乙酰甲基甲醇实验

• 原理：

本实验是测定芽孢杆菌（或其他细菌）发酵葡萄糖的变化。有些芽孢杆菌发酵葡萄糖产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇或2,3-丁二醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色化合物，即表示V.P.试验阳性。若在培养基中加入少量肌酸以补充胍基，可加速反应。反应式如下：
2 丙酮酸——>乙酰甲基甲醇 + 2 二氧化碳；
                   -2H
      乙酰甲基甲醇————>二乙酰；
                   +KOH
  
                           缩合
      二乙酰 + NH=C(NH2)2————>红色化合物

• 培养基和试剂

培养基：
     蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml。调节PH 6.5，每管分装4—5ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min灭菌
试剂：
     40%NAOH(或KOH)，肌酸。

三，步骤：

1. 接种与培养

           将芽孢杆菌测试菌接种于上述培养液中，一般于30摄氏度培养4天。

2. 结果观察

在培养4天后，取培养液（约2ml）和等量的40%NAOH相混合，如少量肌酸（约0.5—1mg），充分振荡，2—5min后如培养液呈红色，即为V.P.试验阳性，有时须放置更长时间才出现红色反应。
 
                     
四  淀粉水解

一、原理：
        许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。

• 培养基及试剂：

      培养基：在肉汤琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装于三角瓶。0.1MPa(15lbf/in2)20min灭菌备用。
      试剂：卢哥尔氏碘液

三、步骤：
        将培养基融化后，冷却至50摄氏度左右，倒成平板，凝固后取菌种点钟于平板上（每皿点钟2点），一般于30摄氏度培养2—4天，形成菌落后，在平板上滴加卢哥尔氏碘液，以铺满菌落为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有五色透明圈出现，说明淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。

附表：培养基的配方

肉汤琼脂培养基 

牛肉膏                                                                     5克        蛋白胨                                                                    10克氯化钠                                                                     5克

琼脂                                                                      18克

蒸馏水                                                                1000毫升 

葡萄糖                                                                    10克
pH                                                                      7.0-7.2
121℃灭菌20min

淀粉培养基 

牛肉膏                                                                     5克        蛋白胨                                                                    10克氯化钠                                                                     5克可溶性淀粉                                                                 2克琼脂                                                                   15-20克蒸馏水                                                                1000毫升 

121℃灭菌20min

V．P.实验培养基 

葡萄糖                                                                     5克        蛋白胨                                                                     5克氯化钠                                                                     5克蒸馏水                                                                1000毫升 

pH                                                                         6.5

121℃灭菌20min

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